Science亮点！ExSeq：完整生物组织的原位空间转录组分析-技术圈

背景介绍

新一代测序技术的革新使得我们对生物体的组学信息有了更深的了解，随着转录组技术的日渐普及，尤其是单细胞转录组技术的突飞猛进，使得我们对组织内细胞异质性的认识有了很大提升，另外，单细胞转录组在鉴定新型细胞亚群层面更是具有独特的优势。但是，无论是传统常规转录组测序，还是单细胞转录组测序，都是以牺牲空间信息为代价的。

空间位置信息对组织内细胞命运选择、胚胎发育以及肿瘤的发生发展等方面具有不可忽略的作用。因此，空间转录组技术应运而生。当前，空间转录组技术无论在技术开发，还是大规模的应用和商业化，都得到了蓬勃发展，更是被Nature Methods评为年度方法，这也预示着该技术有可能引领下一个研究热潮。

另外，绘制转录本的亚细胞位置对于理解不同的生物学过程也很重要，但是，在细胞中对转录本的成像以及更细节的细胞形态的分析则需要依赖纳米级别的精分辨率，想要达到如此高的分辨率并非易事。即使是能够进行高分辨率RNA分子成像的seqFISH+（Sequential fluorescence in situ hybridization）技术也不能解决达到纳米级精度这一难题。

为此，来自MIT、哈佛医学院等单位的科学家合作开发了一种被称之为扩展测序（expansion sequencing, ExSeq）的技术方法，并以“Expansion sequencing: Spatially precise in situ transcriptomics in intact biological systems”为题发表在Science上。该技术提供了一个独特的方法，可以了解哪些基因在细胞的哪些部位表达，并可以让研究者们更多地了解基因表达如何受到细胞位置或其与附近细胞相互作用的影响。

文章发表在Science

主要内容

扩展测序是将组织扩展和原位RNA测序结合起来的一种新型技术。组织扩展技术是通过将吸水聚合物嵌入组织样本中，在保持其整体结构完整性的同时使组织样本膨胀。借助这种方法，组织可以膨胀100倍之多，这使得研究人员可以使用普通的光学显微镜就可以获得非常高分辨率的图像信息。原位RNA测序技术则可以对实验室培养皿里生长的细胞中对数千个mRNA分子进行定位和测序。

具体来讲，扩展测序技术的主要步骤如下：（I）样本固定，将RNA方法分子与Anchor结合；（II）将样品嵌入可膨胀的凝胶材料中；（III）将RNA分子锚定在凝胶材料之中；（IV）使用RISSEQ技术对RNA分子进行逆转录和扩增；（V）原位测序。同时，在原位测序结束后，这些纳米孔中的cDNA被回收送去二代测序，测序结果会与原位测序的结果关联结合起来。这种技术可以使得全长转录组信息及其空间位置都能够得到解读，同时，较长的测序读长还可以实现剪切体的检测，并且这种非靶向的测序还会无偏颇的捕捉转录组信息，意味着研究人员不是在寻找特定的RNA序列，而是可以发现成千上万种不同序列。

图1. 扩展测序基本原理和测序流程，图片来源：Science

为了验证扩展测序的有效性，研究者们分别建立了非靶向和靶向的两种技术方法。其中，通过使用非靶向扩展测序技术，他们对小鼠海马区神经元树突中存在的转录本进行了解读，包括其中滞留的内含子、转录因子以及长非编码RNAs。结果表明，树突中存在含有内含子的mRNA，同时也存在编码转录因子的mRNA分子，这一发现表明了树突可能存在沟通细胞核的新形式。

图2. 小鼠海马区神经元树突非靶向扩展测序，图片来源：Science

除此之外，研究人员还借助靶向扩展测序技术，对小鼠视觉皮层中层与层之间特异性的细胞类型进行解析，并对海马椎体神经元间隔中的RNA进行分析。研究人员发现，棘突中的mRNA分布与相邻的树突是不同的。另外，他们还发现不同类型海马区神经元中RNA树突状结构之间的分布具有相似的模式。

图3. 小鼠视觉皮层靶向扩展测序，图片来源：Science

最后，他们还对人类转移性乳腺癌活检样品进行扩展测序，借助该技术绘制了存在不同细胞类型表达不同基因的图谱，这一图谱可以作为识别不同类型细胞以及不同细胞之间互作的重要参考信息。同时，分析结果也显示，这些细胞类型会因为它们在肿瘤内位置的不同而作出不同的表现。比如，某些炎症基因更高水平地表达在靠近肿瘤细胞的B细胞。

图4. 乳腺癌活检样品扩展测序图片，来源：Science

总的来说，扩展测序可以在完整的细胞和组织中实现从纳米尺度到系统尺度的转录本多通道分析，其在胚胎发育、神经生物学等研究方面具有独特的优势。同时，这一技术也为癌症中细胞相互作用的研究提供了重要工具，为未来研发更加有效的治疗方法提供了理论基础。

图5. 研究总结，图片来源：Science

文章共同通讯作者、麻省理工学院神经技术学教授Ed Boyden说：“基因表达是所有生物学中最基本的过程之一，它在所有健康和疾病相关的生物过程中发挥作用。然而，你需要知道的不仅仅是基因是否开启或关闭，你想知道基因产物的位置。你关心的是它们属于哪种细胞类型，它们在哪个细胞中起作用，甚至它们在细胞的哪个部分起作用。”

参考文献

1. https://science.sciencemag.org/content/371/6528/eaax2656

2. N. Crosetto, M. Bienko, A. van Oudenaarden, Spatially resolved transcriptomics and beyond. Nat. Rev. Genet. 16, 57–66 (2015). doi: 10.1038/nrg3832; pmid: 25446315

3. A. E. Moor et al., Global mRNA polarization regulates translation efficiency in the intestinal epithelium. Science 357, 1299–1303 (2017). doi: 10.1126/science.aan2399; pmid: 28798045。

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