号外 | 陈鹏课题组与王初课题组合作开发蛋白质“扩增测序”新方法
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2024-06-15 21:00
近日，北京大学化学与分子工程学院、北大-清华生命联合中心陈鹏课题组与王初课题组合作，在National Science Review杂志上发表了题为“Amplifiable protein identification via residue-resolved barcoding and composition code counting”的论文。在这项工作中，作者结合氨基酸特异的化学偶联反应、核酸定量扩增技术和计算机辅助的蛋白质指纹识别算法，开发了一种蛋白质“扩增测序”的新方法（AmproCode），为开发新一代的蛋白质测序方法提供了全新的思路。
蛋白质是生命功能的基石，单分子、单细胞水平的蛋白质测序技术能够为科学研究带来突破性的进展，并推动人类疾病诊断和治疗的进步。尽管基于质谱的蛋白质组学技术能够快速、高通量地鉴定生物样品中的蛋白质，但是与更为成熟的核酸测序技术相比，尚不能借助类似聚合酶链式反应（PCR）的技术直接扩增蛋白质分子，低丰度蛋白质的测序依然存在巨大的挑战。
近些年，为了解决这一问题，研究者们努力将各类高灵敏的分析技术应用到蛋白质测序领域，例如单分子光学技术、单分子力学技术、DNA纳米技术、纳米孔技术等等。这些单分子蛋白质测序的尝试大多依赖于高灵敏的单分子分析设备。而本工作中，作者则借助氨基酸侧链特异的偶联反应，将DNA“条码”标记到目标氨基酸的侧链上，结合qPCR定量放大DNA信号，实现蛋白质中特定氨基酸的“编码”与“扩增”。同时，作者还为之“量身定做“了蛋白质解析的计算机程序，以分析qPCR定量的氨基酸比例信号，完成对数据库中蛋白质的指认（图1）。这个全新的高灵敏蛋白质“扩增测序”技术被命名为AmproCode。
作者首先设计了AmproCode技术的蛋白质解析程序。作者用一个个矩阵记录蛋白质组中每条蛋白质的选定氨基酸的比例信息，并计算它们与输入信号矩阵的余弦距离，以评价蛋白质是否被成功鉴定。作者尝试利用计算机模拟评估在此算法下AmproCode技术对蛋白质组的覆盖程度。计算模拟结果表明，四到五类的氨基酸的比例信息便足以成功覆盖超过90%的人类全蛋白质组和分泌蛋白质组。这为AmproCode技术提供了坚实的理论依据。
随后，作者综合考虑反应速率、效率、特异性等因素，为AmproCode技术选择了五类氨基酸特异的偶联反应，包括半胱氨酸和马来酰亚胺的反应、赖氨酸和活化酯的反应、甲硫氨酸和氮杂环氧丙烷的反应、天冬氨酸/谷氨酸和胺基的反应、以及酪氨酸和重氮苯甲醛的反应。作者在小分子和多肽上分别测试了上述反应，并且设计了对应的DNA标记策略，完成了多肽上氨基酸侧链特异的DNA标记（图2）。其中前四类反应效率较高，作者优先选用它们进行后续的实验，而酪氨酸的反应效率和特异性偏低，作为备选。
作者在两条合成的分泌组多肽ELA和URP上展示了AmproCode技术的应用潜力。作者对多肽分别进行了半胱氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸/谷氨酸特异的DNA标记和qPCR定量，获得了它们的比例信息，并借助蛋白质解析程序成功将ELA和URP肽从分泌组数据库中分别指认（图3）。AmproCode能够在低至飞摩尔每升的浓度（fmol/L）指认数据库中的目标多肽，比质谱和ELISA灵敏10到10000倍，展示了其超灵敏的蛋白质鉴定能力。
如果借助合适的分离与富集技术，AmproCode技术也能用于混合样品中目标蛋白质的识别。作者借助SrtAβ酶从混合物中分离Aβ肽，扩增并定量了其半胱氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸的比例，并在分泌组数据库中完成了Aβ肽的鉴定，展示了AmproCode技术在生物标志物的检测和发现方面的潜在应用价值。
最后，作者再次借助计算机模拟，评估了不同实验参数对AmproCode性能的影响。模拟结果表明，氨基酸定量的误差比较容易影响蛋白质识别的成功率，但是标记定量更多的氨基酸则能够显著削弱实验误差的影响，提高 AmproCode技术的鉴定成功率（图4）。因此，在未来利用更多氨基酸特异的化学反应标记并定量更多种类的氨基酸，能够显著提升AmproCode技术的准确性、对蛋白质组覆盖率和应用普适性。
综上，本工作开发了一种蛋白质“扩增测序”新技术——AmproCode。作为一种将蛋白质转化为可扩增分子的突破性技术，它为开发下一代蛋白质测序技术提供了全新的思路，在未来可能推动单细胞蛋白质组学以及临床标志物鉴定的技术突破。作者也认为这项工作能够吸引更多化学家关注蛋白质科学，开发更多氨基酸特异的化学反应，为蛋白质测序以及蛋白质化学生物学的提供更多优秀的新工具。
北京大学化学与分子工程学院、北大-清华生命联合中心陈鹏教授和王初教授为本文的共同通讯作者。陈鹏课题组2019级博士研究生郭玮明、王初课题组副研究员刘源和陈鹏课题组博士后韩雨是本文的共同第一作者，唐欢博士，樊新元副教授等合作者也为本课题做出了贡献。该工作得到了科技部国家重点研发计划、国家自然科学基金委、北京市自然科学基金委以及腾讯探索奖的资金支持。