GATK教程 / 体细胞短变异检测 (SNV+InDel)流程概览-技术圈

体细胞短变体检测 (SNV + InDel)

Somatic short variant discovery (SNVs + Indels)

目的

在单个个体的一个或多个肿瘤样本中，识别体细胞短变异(SNV和InDel)，无论是否有匹配的正常样本(With or without a matched normal sample)。

参考实现

管道	总结	笔记	Github	Terra
体细胞短变异体Tumor-Normal配对	T-N Bam到VCF	通用	有	b37
体细胞短变异PON的生成	正常样本Bam到PON	通用	有	b37

另见文件：

gatk-master.zip

(How to) Call somatic mutations using GATK4 Mutect2.docx

链接：https://pan.baidu.com/s/1BTmmCM-mJ-hEA1wWNYDs4g

提取码：ysx4

预期的输入

该工作流程需要为每个输入的肿瘤和正常样本(Each input tumor and normal sample)提供BAM文件。输入Bam应按照《GATK数据预处理最佳实践 (GATK Best Practices for data pre-processing)》中的描述进行预处理：

https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/articles/360035535912

体细胞短变异检测最佳流程实践图 (Mutect2)

主要步骤

这个工作流有两个主要步骤：① 首先，生成大量的候选体细胞变异；② 然后，对它们进行筛选，以获得更有信心的体细胞变异调用集合 (A more confident set of somatic variant calls)。

检测候选变异(Call candidate variants)

工具：Mutect2

https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/articles/5358824293659--Tool-Documentation-Index#Mutect2

与HaplotypeCaller一样，Mutect2通过激活区内的单倍型的局部de-novo组装 (Local de-novo assembly of haplotypes in an active region)，同时调用(Call)SNV和InDel，最终由Bam文件(+参考基因组)获得VCF文件。

也就是说，当Mutect2遇到一个显示出体细胞变异迹象的区域时，它会丢弃现有的映射/比对信息，并完全重新组装该区域的Reads (Completely reassembles the reads in that region)，以生成候选的变异单倍型 (Candidate variant haplotypes)。

与HaplotypeCaller一样，Mutect2随后会通过Pair-HMM算法将每个Read与每个单倍型进行比对 (Aligns each read to each haplotype)，从而获得一个可能性矩阵。最后，它应用贝叶斯体细胞可能性模型 (Bayesian somatic likelihoods model)来获得等位基因为体细胞变异相对于测序错误的对数几率 (Obtain the log odds for alleles to be somatic variants versus sequencing errors)。

非遗传性肿瘤测序数据分析的难点

不像胚系突变(人体中所有细胞的遗传物质、基因型、突变型基本一致)，体细胞突变的取样和测序数据生信分析都有一定的难度。① 取样：需要尽量获取受累组织(需要仔细甄别细胞外观，甚至生化检测结果)，否则如果肿瘤细胞占比很极低时，将影响整个数据的分析结果，甚至导致错误的结论；② 数据分析：在取样没有问题时才可进行(极大地受到肿瘤细胞占比等因素影响)。即使肿瘤占比较高，但是由于肿瘤突变的异质性很强，许多与肿瘤相关的突变的突变频率极低，甚至低于测序仪的检测错误率。因此，肿瘤WES分析通常要求能够准确检测到低至0.5% ~ 10%的突变丰度，这就是体细胞分析最大的难点，也是与胚系突变检测的最大不同(胚系突变一旦发生，对于人类等二倍体生物来说，就至少是杂合子，即至少50%的理论突变率)。

因此，整个非遗传性肿瘤(即由于后天的基因突变引起的肿瘤)的体细胞检测流程一直在克服以下几个问题：① 样本交叉污染；② PCR扩增等建库过程中引入的“假阳性”突变；③ 测序仪引入的测序错误 (约1%，测序仪的真实测序碱基质量值非常重要)；④ 病人自身携带的先天遗传突变 (生下来就有的、与参考基因组所不同的碱基序列)，需过滤自身正常组织或癌旁组织的突变；⑤ 需过滤克隆性造血过程中自身白细胞等细胞中携带的突变；⑥ 过滤掉其它与肿瘤无关的体细胞突变。最终才是与肿瘤有关的体细胞突变。

计算污染

涉及的工具：GetPileupSummaries, CalculateContamination

https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/articles/5358824293659--Tool-Documentation-Index#GetPileupSummaries

https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/articles/5358824293659--Tool-Documentation-Index#CalculateContamination

该步骤对每个肿瘤样本中存在交叉样本污染 (Cross-sample contamination)的Reads的分数/比例进行估计，并对每个肿瘤样本的等位基因拷贝数分段(Allelic copy number segmentation)进行估计。

与其它污染计算工具不同，CalculateContamination被设计成即使在有显著拷贝数变异的样本中，也可以在没有匹配正常样本 (Without a matched normal)的情况下很好地工作，并且对污染样本的数量不做任何假设。

Learn Orientation Bias Artifacts

工具：LearnReadOrientationModel

该工具使用Mutect2的可选F1R2计数输出(F1R2 counts output)来学习定向偏差模型(A model for orientation bias)的参数。它在为每个三核苷酸上下文 (Each trinucleotide context)排序之前，找到单链替换错误的先验概率 (Prior probabilities)。这对于FFPE肿瘤样本是极其重要的。

过滤变异 (Filter Variants)

工具包括：FilterMutectCalls

https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/articles/5358824293659--Tool-Documentation-Index#FilterMutectCalls

Mutect2的体细胞可能性模型(Somatic likelihoods model)假设Read的错误是独立发生的，因此，例如，4个Reads，每1个Read的错误概率为1/1000，产生大约1000^4的对数几率 (A log odds of roughly 1000^4)，有利于其成为真正的变异，而不是测序错误。

FilterMutectCalls解释了相关的错误，也就是说，一个位点上所有的变异Reads都是由于某种共同的错误来源 (Due to some common source of error)的可能性。它通过几个硬过滤 (Several hard filters)来实现这一目标，以检测：“Alignment artifacts and probabilistic models for strand and orientation bias artifacts”(比如PCR产生的错误，会被后续的PCR循环传递下去，就出现“某种共同的错误来源”)、聚合酶滑移(Slippage artifacts,)、胚系变异和污染(都会出现“某种共同的错误来源”)。原因是：肿瘤体细胞突变相对随机，且通过超声法破碎后Reads长度大小不一。也因为如此，克隆性造血过程中自身白细胞等细胞中携带的突变，以及其它与肿瘤无关的体细胞突变将无法被过滤(除非做了患者自身配对的WBC实验设计及测序)，因为这类突变也是：“相对随机，且通过超声法破碎后Reads长度大小不一”。

此外，FilterMutectCalls学习了一个关于肿瘤的整体SNV和InDel突变率和等位基因分数谱的贝叶斯模型，以改进Mutect2发出的对数几率 (A Bayesian model for the overall SNV and indel mutation rate and allele fraction spectrum of the tumor to refine the log odds emitted by Mutect2)。然后，它会自动设置一个过滤阈值，以优化：F评分、灵敏度和精度的调和平均值(F score, the harmonic mean of sensitivity and precision)。