scATAC-seq建库原理，质控方法和新R包Signac的使用-技术圈

生物信息学习的正确姿势

NGS系列文章包括NGS基础、在线绘图、转录组分析（Nature重磅综述|关于RNA-seq你想知道的全在这）、ChIP-seq分析（ChIP-seq基本分析流程）、单细胞测序分析 (重磅综述：三万字长文读懂单细胞RNA测序分析的最佳实践教程)、DNA甲基化分析、重测序分析、GEO数据挖掘（典型医学设计实验GEO数据分析 (step-by-step)）、批次效应处理等内容。

ATAC-seq即transposase-accessible chromatin using sequencing，是一种检测染色体开放区域的技术。该方法由斯坦福大学Greenleaf实验室在2013年首次发表[1]，两年后该实验室又发表基于单细胞的ATAC-seq技术[2]。ATAC-seq相比于之前的FaiRE-seq和DNase-seq，ATAC-seq用Tn5转座酶对染色体开放区域进行剪切，并加上adaptors序列（图1的红蓝片段）。最后得到的DNA片段，包括了开放区域的剪切片段，以及横跨一个或多个核小体的长片段。

图1. ATAC-seq[1]

根据片段长度可以分为Fragments in nucleosome-free regions(<147 base pairs)和Fragments flanking a single nucleosome (147~294 base pairs), 以及更长的多核片段。片段长度分布如下图，没有跨越核小体的小片段最多，其次是单核片段，依次递减。
图2. DNA片段长度分布

scATAC-seq建库原理

以10x 建库方法为例[5]，比较scATAC-seq 和scRNA-seq建库方法的异同。
二者都用胶珠（GEMs）的方法，不一样的是ATAC胶珠上的序列中不用UMI，因为基因组只有一对序列，无需像RNA一样定量。另外序列末端用接头引物Read 1N代替PolyT。

scRNA-seq通过结合cDNA的PolyA尾进行扩增，而scATAC-seq的DNA片段没有PolyA尾，取而代之的是Tn5酶转座剪切时插入的adaptors片段，可以与胶珠上的Read 1N序列互补。

DNA片段接上胶珠后，在另一端加Read2和Sample index序列。在此之前，scRNA-seq需要将cDNA酶切至合适的片段长度，而scATAC-seq的片段不进行打碎，接上Sample index和P7序列后进行扩增。

最后上机测序。scRNAseq如果是3‘单端测序，Read2读取最近的100bp读长，而Read1只读取16bp的细胞barcode序列和10bp的UMI序列，共26bp。scATAC-seq则用双末端测序，读长一般不低于45bp[3]。

scATAC-seq最后可以得到4个原始文件：

其中I1/2分别是barcode和sample index，R1/2是目的片段的双末端。

10x提供cellranger软件对原始数据进行初步分析，如质控，比对，peak calling等。

$ cellranger-atac count --id=sample345 \
--reference=/opt/refdata-cellranger-atac-GRCh38-1.2.0 \
--fastqs=/home/jdoe/runs/HAWT7ADXX/outs/fastq_path \
--sample=mysample \
--localcores=8 \
--localmem=64

质控方法

重要指标：

Fraction of fragments overlapping any targeted region
覆盖注释区域的片段比例。目标区域包括TSS，DNase HS，增强子和启动子等。一般要求大于55%。
Fraction of transposition events in peaks in cell barcodes
转座位点位于peaks区域的比例。一般大于25%。如果比例过小，有可能是细胞状态不好，或者测序深度不够。
Enrichment score of transcription start sites(TSS)
转录起始位点的标准化分数。阈值选择根据基因组而定。人类一般选择TSS分数大于5或者6的细胞样本[3]。如果分数太低说明细胞染色质结构瓦解，或者实验过程细胞裂解方式不当。

TSS标准化分数的计算方法不同，可能导致阈值偏差。10X的标准化方法是cut sites数除以最小值，而ENCODE的标准是在cut sites数除以两个末端各100bp的cut site数的平均值。由于一般越靠近中间数值越大，ENCODE的标准化分数整体比10x的分数小一些。

其他指标：

Fraction of read pairs with a valid barcode > 75%;
Q30 bases in R1 > 65%;
Q30 bases in R2 > 65%;
Q30 bases in barcode > 65%;
Q30 bases in Sample Index > 90%;
Estimated Number of Cells 500~10000 +- 20%;
Median fragments per cell barcode > 500;
Fragments in nucleosomefree regions >55%;
Fraction of total read pairs mapped confidently to genome (>30 mapq) >80%;
Fraction of total read pairs in mitochondria and in cell barcodes < 40%;

下游分析（以Signac为例）

Signac包由Seurat同一团队开发，独立于Seurat包，在2020年8月开始发布在GitHub上。目前仍是1.0.0版本[4]。

我们可以用10x官网的PBMC数据做演示。

首先加载所需R包：

library(Signac)
library(Seurat)
library(GenomeInfoDb)
library(EnsDb.Hsapiens.v75)
library(ggplot2)
library(patchwork)
set.seed(1234)

加载peaks, 细胞注释和片段分布数据，并创建object。这个object和Seurat object类似，只是在assay里多了peaks等信息。

counts<-Read10X_h5(filename= "atac_v1_pbmc_10k_filtered_peak_bc_matrix.h5")
metadata <- read.csv(
  file = "atac_v1_pbmc_10k_singlecell.csv",
  header = TRUE,
  row.names = 1
)
chrom_assay <- CreateChromatinAssay(
  counts = counts,
  sep = c(":", "-"),
  genome = 'hg19',
  fragments = 'atac_v1_pbmc_10k_fragments.tsv.gz',
  min.cells = 10,
  min.features = 200
)
pbmc <- CreateSeuratObject(
  counts = chrom_assay,
  assay = "peaks",
  meta.data = metadata
)

总共8728个细胞，87405个features。features不是基因，是基因组的注释区域，如启动子，增强子等。

pbmc[['peaks']]
## ChromatinAssay data with 87405 features for 8728 cells
## Variable features: 0
## Genome: hg19
## Annotation present: FALSE
## Motifs present: FALSE
## Fragment files: 1

加载注释:

extract gene annotations from EnsDb
annotations <- GetGRangesFromEnsDb(ensdb = EnsDb.Hsapiens.v75)
# change to UCSC style since the data was mapped to hg19
seqlevelsStyle(annotations) <- 'UCSC'
genome(annotations) <- "hg19"
# add the gene information to the object
Annotation(pbmc) <- annotations

TSS和blacklist比例计算。

# compute nucleosome signal score per cell
pbmc <- NucleosomeSignal(object = pbmc)
# compute TSS enrichment score per cell
pbmc <- TSSEnrichment(object = pbmc, fast = FALSE)
# add blacklist ratio and fraction of reads in peaks
pbmc$pct_reads_in_peaks <- pbmc$peak_region_fragments / pbmc$passed_filters * 100
pbmc$blacklist_ratio <- pbmc$blacklist_region_fragments / pbmc$peak_region_fragments
pbmc$high.tss <- ifelse(pbmc$TSS.enrichment > 2, 'High', 'Low')
TSSPlot(pbmc, group.by = 'high.tss') + NoLegend()

质控。Signac包用5个指标做过滤：

TSS富集分数，大于2；
blacklist比例，小于0.05；
缠绕核小体的片段与非核小体片段（< 147bp）的比例，小于4；
匹配peaks区域的片段比例，大于15%；
匹配peaks区域的片段数，大于3000，小于20000。

pbmc <- subset(
  x = pbmc,
  subset = peak_region_fragments > 3000 &
    peak_region_fragments < 20000 &
    pct_reads_in_peaks > 15 &
    blacklist_ratio < 0.05 &
    nucleosome_signal < 4 &
    TSS.enrichment > 2
)
pbmc
## An object of class Seurat
## 87405 features across 7060 samples within 1 assay
## Active assay: peaks (87405 features, 0 variable features)

降维聚类。

pbmc <- RunTFIDF(pbmc)
pbmc <- FindTopFeatures(pbmc, min.cutoff = 'q0')
pbmc <- RunSVD(pbmc)
pbmc <- RunUMAP(object = pbmc, reduction = 'lsi', dims = 2:30)
pbmc <- FindNeighbors(object = pbmc, reduction = 'lsi', dims = 2:30)
pbmc <- FindClusters(object = pbmc, verbose = FALSE, algorithm = 3)
DimPlot(object = pbmc, label = TRUE) + NoLegend()

创建基因活性矩阵。之前的聚类区域所用的features是peaks，为了展示不同分群基因活性的差异，首先要创建一个类似RNA表达的矩阵。用基因加上游2000bp区域的比对片段数代表该基因的活性。

gene.activities <- GeneActivity(pbmc)
# add the gene activity matrix to the Seurat object as a new assay and normalize it
pbmc[['RNA']] <- CreateAssayObject(counts = gene.activities)
pbmc <- NormalizeData(
  object = pbmc,
  assay = 'RNA',
  normalization.method = 'LogNormalize',
  scale.factor = median(pbmc$nCount_RNA)
)

展示marker基因活性：

DefaultAssay(pbmc) <- 'RNA'

FeaturePlot(
  object = pbmc,
  features = c('MS4A1', 'CD3D', 'LEF1', 'NKG7', 'TREM1', 'LYZ'),
  pt.size = 0.1,
  max.cutoff = 'q95',
  ncol = 3
)

与scRNA-seq数据的整合分析。单细胞转录组数据地址

# Load the pre-processed scRNA-seq data for PBMCs
pbmc_rna <- readRDS("/home/stuartt/github/chrom/vignette_data/pbmc_10k_v3.rds")
transfer.anchors <- FindTransferAnchors(
  reference = pbmc_rna,
  query = pbmc,
  reduction = 'cca'
)
predicted.labels <- TransferData(
  anchorset = transfer.anchors,
  refdata = pbmc_rna$celltype,
  weight.reduction = pbmc[['lsi']],
  dims = 2:30
)
pbmc <- AddMetaData(object = pbmc, metadata = predicted.labels)

寻找细胞分群特异的peaks。

# change back to working with peaks instead of gene activities
DefaultAssay(pbmc) <- 'peaks'
da_peaks <- FindMarkers(
  object = pbmc,
  ident.1 = "CD4 Naive",
  ident.2 = "CD14 Mono",
  min.pct = 0.2,
  test.use = 'LR',
  latent.vars = 'peak_region_fragments'
)
plot1 <- VlnPlot(
  object = pbmc,
  features = rownames(da_peaks)[1],
  pt.size = 0.1,
  idents = c("CD4 Memory","CD14 Mono")
)
plot2 <- FeaturePlot(
  object = pbmc,
  features = rownames(da_peaks)[1],
  pt.size = 0.1
)
plot1 | plot2

展示基因在不同细胞类型的开放程度：

# set plotting order
levels(pbmc) <- c("CD4 Naive","CD4 Memory","CD8 Naive","CD8 Effector","DN T","NK CD56bright","NK CD56Dim","pre-B",'pro-B',"pDC","DC","CD14 Mono",'CD16 Mono')

CoveragePlot(
  object = pbmc,
  region = rownames(da_peaks)[1],
  extend.upstream = 40000,
  extend.downstream = 20000
)

此外还有其他分析，如TF footprinting等。footprinting顾名思义是指转录因子留下的印记，由于Tn5酶不能剪切到TF结合的区域，所以footprinting图相对与TSS图，中间有“凹陷”，凹陷的程度根据TF结合的时间确定[6]。

总的来说，Signac包是一个亲民实用的工具。虽然有一些不足的地方，如染色体的注释目前只能选择UCSC的，不能选Ensemble。

参考文献：

[1] Buenrostro, J., Giresi, P., Zaba, L. et al. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods 10, 1213–1218 (2013). https://doi.org/10.1038/nmeth.2688

[2] Buenrostro, J., Wu, B., Litzenburger, U. et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature 523, 486–490 (2015). https://doi.org/10.1038/nature14590

[3] https://www.encodeproject.org/atac-seq/

[4] https://satijalab.org/signac/index.html

[5]https://assets.ctfassets.net/an68im79xiti/Cts31zFxXFXVwJ1lzU3Pc/fe66343ffd3039de73ecee6a1a6f5b7b/CG000202_TechnicalNote_InterpretingCellRangerATACWebSummaryFiles_Rev-A.pdf

[6] Sung, M., Baek, S. & Hager, G. Genome-wide footprinting: ready for prime time?. Nat Methods 13, 222–228 (2016). https://doi.org/10.1038/nmeth.3766

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